VINEO™ Brettanomytest PCR Kit Ref.
TABLE OF CONTENTS 1 - INTRODUCTION 2 - PRINCIPLE BEHIND THE VINEO™ Brettanomytest PCR Kit 3 - KIT COMPOSITION 4 - VALIDITY AND PRESERVATION 5 - REQUIRED EQUIPMENT THAT IS NOT PROVIDED 6 - PRECAUTIONS AND RECOMMENDATIONS 7 - SAMPLING AND TRANSPORT OF SAMPLES 8 - DNA EXTRACTION 9 - REAL-TIME PCR 10 - ANALYSIS OF THE DATA 11 - INTERPRETATION OF THE RESULTS 12 - CONFIRMATION PROTOCOL FROM ISOLATED COLONIES 13 - TEST PERFORMANCE AND VALIDATIONS APPENDIX A - PCR AMPLIFICATION REAGENT MIXTURE PREPARATION TABLE AP
1 - INTRODUCTION Brettanomyces bruxellensis is a type of yeast that is responsible for the presence of 4-ethyl Phenol and 4-ethylguaiacol in wine-type drinks, fruit juices and beers that involves significant economic losses. In wines, its presence is difficult to detect using classic culture methods, which take a long time and are non-specific.
• Negative • Low population, controlled risk • Critical population to be monitored • Very high population, risk of production of volatile Phenols The VINEO™ Brettanomytest PCR Kit can also be used in a qualitative mode to confirm isolated colonies from a culture medium. 2 - PRINCIPLE BEHIND THE VINEO™ Brettanomytest PCR Kit This test is based on amplification, detection and quantification of DNA sequences using the real-time PCR technique.
This test is used to detect and quantify Brettanomyces bruxellensis in the DNA extracted from fermented drinks produced from grape and fermenting grape musts. TAKING THE SAMPLE DNA EXTRACTION VINEO™ Extract DNA Kit (Ref.: 354-8100) DNA AMPLIFICATION by PCR IN REAL TIME VINEO™ Brettanomytest PCR Kit (Ref.: 354-8101) ANALYSIS & INTERPRETATION Opticon Monitor™ or CFX Manager™ IDE 3 - KIT CONTENTS Stoppers Designation Reagent Volume Pink Fluorescent probes Fluorescent probes 1 tube (0.
Consumables: • For the plates, PCR tubes and stop caps: - White plates of 96 "Low-profile" wells, ref. Bio-Rad: MLL-9651 - White plates of 48 "Low-profile" wells, ref. Bio-Rad: MLL-4851 - Strips of 8 tubes of 200μl "Low-profile", ref. Bio-Rad: TLS-0851 - Strips of 8 flat optical stop caps for tubes or plates of 0.2 mL wells, 120 strips ref.
We strongly recommend that you read the complete protocol before beginning the trial. Follow the suggested protocol scrupulously. 7 - SAMPLING AND TRANSPORT OF SAMPLES Wine samples are collected under aseptic conditions in sterile glass or polyethylene recipients or recipients made out of similar material. The samples must be submitted to the laboratory as quickly as possible, preferably within 24 and not more than 48 after taking the sample.
2.2 After preparation, the reagent mix (amplification and probe solutions) must be used immediately, or can be stored for 2 hours between +2°C and +8°C. 2.3 Distribute 45 μl of this reagent mixture per well according to the defined plate surface. Appendices B and C propose plate surfaces to be used for the Chromo4™/CFX96™ and MiniOpticon™ thermocyclers respectively. Add 5 μl of sample or negative control or Qs PCR positive control and seal the wells on the plate or the strips hermetically.
You must use the the Opticon Monitor™ software (version 3.3 and higher) or the CFX Manager™ software Industrial Diagnostic Edition for an automated and quantitative interpretation. A complete report may be printed (cf. software instructions). 1. Controls Before a final interpretation of the results, you have to check the results of the negative and positive controls.
Interpretation of results obtained for the samples: Detection of Brettanomyces bruxellensis (FAM) Detection of the internal control Ct ≥ 10*** Not significant Positive Ct = N/A CtHEX ≥ 28 Negative Ct = N/A Ct = N/A Inhibition** Interpretation **: In the event of a null value for a sample and its internal control (Ct = N/A), the analysis must be done again with the diluted DNA sample (diluted to 1/5th or to 1/10th for example).
APPENDIX A - PCR AMPLIFICATION REAGENT MIXTURE PREPARATION TABLE Use this table to determine the required quantities of fluorescent probes and amplification solution to prepare the PCR reagent mixture. Calculation of the number of samples must include the 2 positive Qs PCR controls and the negative control.
APPENDIX B PLATE SETUP FOR THE Chromo4™/CFX96™ THERMOCYCLERS The first 3 wells in column 1 may be used to analyse the 3 control points. The other wells in the plate will be used for the samples to be analysed. 1 A 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 QS B QS C NC D Sample E Sample F … G H NC: Negative PCR control QS: Positive Qs PCR control APPENDIX C PLATE SETUP FOR THE MiniOpticon™ THERMOCYCLER The first 3 wells in column 1 may be used to analyse the 3 control points.
NOTICE OF CONCERN TO THE PURCHASER: LIMITED LICENSE Use of this product is covered by one or more of the following US patents and the corresponding patent claims outside the United States: 5 079 352, 5 789 224, 5 618 711, 6 127 155, 5 677 152 (claims 1 to 23 only) and 5 773 258 (claims 1 and 6 only) and by the claims outside the United States that correspond to US patent n° 4 889 818.
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VINEO™ Brettanomytest PCR Kit Réf.
SOMMAIRE 1 - INTRODUCTION 2 - PRINCIPE DU VINEO™ Brettanomytest PCR Kit 3 - COMPOSITION DU KIT 4 - VALIDITE ET CONSERVATION 5 - EQUIPEMENT ET MATERIEL NECESSAIRES NON FOURNIS 6 - PRECAUTIONS ET RECOMMANDATIONS 7 - PRELEVEMENT ET TRANSPORT DES ECHANTILLONS 8 - EXTRACTION DE L’ADN 9 - PCR EN TEMPS REEL 10 - ANALYSE DES DONNEES 11 - INTERPRETATION DES RESULTATS 12 - PROTOCOLE DE CONFIRMATION A PARTIR DE COLONIES ISOLEES 13 - PERFORMANCES DU TEST ET VALIDATIONS ANNEXE A - TABLEAU DE PREPARATION DU MELANGE REAC
1 - INTRODUCTION Brettanomyces bruxellensis est une levure responsable de la présence des 4-ethyl Phénol et 4-ethyl Guaiacol dans les boissons de type vins, jus de fruits et bières impliquant des pertes économiques importantes. Dans les vins, sa présence est difficile à détecter par les méthodes de culture classiques qui sont longues et non spécifiques.
• Négatif • Population faible, risque maîtrisé • Population critique à surveiller • Population très élevée, risque de production de Phénols volatils Le VINEO™ Brettanomytest PCR Kit peut également être utilisé sur un mode qualitatif pour la confirmation de colonies isolées à partir d’un milieu de culture. 2 - PRINCIPE DU VINEO™ Brettanomytest PCR Kit Ce test repose sur l’amplification, la détection et la quantification de séquences d’ADN par la technique de PCR en temps réel.
pour réaliser une analyse automatique et quantitative. Une interprétation concernant le risque lié à la présence de Brettanomyces bruxellensis est alors proposée à l’utilisateur. Ce test permet la détection et la quantification de Brettanomyces bruxellensis dans les ADN extraits à partir de boissons fermentées issues de raisin et des moûts en fermentation. PRÉLÈVEMENT DE L’ÉCHANTILLON EXTRACTION ADN VINEO™ Extract DNA Kit (Réf.
• 20 μl, 200 μl and 1000 μl micropipettes • Multi-distributeur, tel que combitip pipettes Remarque : Nous recommandons l’utilisation d’un onduleur électrique avec le thermocycleur. Consommables : • Pour les plaques, tubes PCR et capuchons : - Plaques blanches de 96 puits “Low-profile”, réf. Bio-Rad: MLL-9651 - Plaques blanches de 48 puits “Low-profile”, réf. Bio-Rad: MLL-4851 - Barrettes de 8 tubes de 200 μl “Low-profile”, réf.
doigts sur le film optique utilisé pour sceller les microplaques. Ne pas écrire sur les bouchons des tubes PCR. Dans les deux cas, l’enregistrement des données par l’appareil peut être perturbé. Nous vous recommandons vivement de lire l'ensemble du protocole avant de commencer l'essai. Respecter scrupuleusement le protocole proposé.
2.2 Après préparation, le mélange réactionnel (Solutions d’amplification et de sondes) doit être utilisé immédiatement, ou il peut être conservé pendant 2 heures de +2°C à +8 °C. 2.3 Répartir 45 μl de ce mélange réactionnel par puits, selon le plan de plaque défini. Les Annexes B et C proposent des plans de plaque à utiliser respectivement sur les thermocycleurs Chromo4™/CFX96™ et MiniOpticon™.
Il est nécessaire d’utiliser les logiciels Opticon Monitor™ (version 3.3 et plus) ou CFX Manager™ Industrial Diagnostic Edition pour une interprétation automatisée et quantitative. Un rapport complet pourra être imprimé (Cf. notice d’utilisation des logiciels). 1. Contrôles Avant l’interprétation finale des résultats il est nécessaire de vérifier les résultats des contrôles négatif et positif.
Interprétation des résultats obtenus sur les échantillons : Détection de Brettanomyces Détection du contrôle interne bruxellensis (FAM) Ct ≥ 10*** Non significatif CtHEX ≥ 28 Ct = N/A Ct = N/A Ct = N/A Interprétation Positif Négatif Inhibition** ** : En cas de valeur nulle pour un échantillon et son contrôle interne (Ct = N/A), l’analyse doit être renouvelée avec l’échantillon d’ADN dilué (au 1/5e ou au 1/10e par exemple).
ANNEXE A - TABLEAU DE PREPARATION DU MELANGE REACTIONNEL D’AMPLIFICATION PCR Utiliser ce tableau pour déterminer les quantités nécessaires de sondes fluorescentes et solution d’amplification pour préparer le mélange réactionnel de PCR. Le calcul du nombre d’échantillons doit inclure les 2 contrôles positifs Qs PCR et le contrôle négatif.
ANNEXE B PLAN DE PLAQUE A UTILISER SUR LES THERMOCYCLEURS Chromo4™/CFX96™ Les 3 premiers puits de la colonne 1 peuvent être utilisés pour analyser les 3 points de contrôles. Les autres puits de la plaque seront utilisés pour déposer les échantillons à analyser.
AVIS CONCERNANT L'ACHETEUR : LICENCE LIMITEE L’utilisation de ce produit est couverte par un ou plusieurs des brevets US suivants et les revendications de brevet correspondantes hors Etats-Unis : 5 079 352, 5 789 224, 5 618 711, 6 127 155, 5 677 152 (revendications 1 à 23 seulement) et 5 773 258 (revendications 1 et 6 seulement) et par les revendications hors Etats-Unis correspondant au brevet US n° 4 889 818.
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VINEO™ Brettanomytest PCR Kit Ref.
ÍNDICE 1 - INTRODUCCIÓN 2 - PRINCIPIO DEL Kit VINEO™ Brettanomytest PCR Kit 3 - COMPOSICIÓN DEL KIT 4 - CADUCIDAD Y CONSERVACIÓN 5 - EQUIPO Y MATERIAL NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 6 - PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES 7 - EXTRACCIÓN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS 8 - EXTRACCIÓN DEL ADN 9 - PCR EN TIEMPO REAL 10 - ANÁLISIS DE DATOS 11 - INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 12 - PROTOCOLO DE CONFIRMACIÓN A PARTIR DE COLONIAS AISLADAS 13 - RENDIMIENTOS DE LA PRUEBA Y VALIDACIONES ANEXO A.
1 - INTRODUCCIÓN La Brettanomyces bruxellensis es una levadura responsable de la presencia de 4-etil fenol y 4-etil guayacol en bebidas como los vinos, los zumos de frutas y las cervezas que causan pérdidas económicas importantes. Resulta difícil detectar su presencia en los vinos mediante los métodos de cultivo clásicos, que son largos y no específicos.
• Negativo • Población pequeña, riesgo controlado • Población crítica que debe vigilarse • Población muy elevada, riesgo de producción de fenoles volátiles El kit VINEO™ Brettanomytest PCR Kit puede usarse asimismo de modo cualitativo para confirmar colonias aisladas a partir de un medio de cultivo. 2 - PRINCIPIO DEL Kit VINEO™ Brettanomytest PCR Kit Esta prueba se basa en la amplificación, detección y cuantificación de secuencias de ADN mediante la técnica de PCR en tiempo real.
Esta prueba permite detectar y cuantificar la Brettanomyces bruxellensis en los ADN extraídos a partir de bebidas fermentadas procedentes de la uva y de mostos en fermentación. EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA EXTRACCIÓN DE ADN – VINEO™ Extract DNA Kit (Ref.: 354-8100) AMPLIFICACIÓN de ADN PCR EN TIEMPO REAL VINEO™ Brettanomytest PCR Kit (Ref.: 354-8101) ANÁLISIS e INTERPRETACIÓN Opticon Monitor™ o CFX Manager™ IDE 3 - COMPOSICIÓN DEL KIT Este kit contiene la cantidad de reactivos necesaria para 96 reacciones.
Consumibles: • Para las placas, tubos PCR y tapones: - Placas blancas de 96 pocillos de perfil bajo; ref. Bio-Rad: MLL-9651 - Placas blancas de 48 pocillos de perfil bajo; ref. Bio-Rad: MLL-4851 - Tiras de 8 tubos de 200μl de perfil bajo, ref. Bio-Rad: TLS-0851 - Tiras de 8 tapones ópticos planos para tubos o placas de pocillos de 0,2 mL, 120 tiras, ref.
Recomendamos encarecidamente leer el protocolo completo antes de comenzar el ensayo. Cumpla escrupulosamente el protocolo propuesto. 7 - EXTRACCIÓN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS Las muestras de vino se recogen, en condiciones asépticas, en recipientes estériles de vidrio, polietileno o de otro material parecido. Las muestras deben enviarse al laboratorio lo más rápidamente posible, preferentemente antes de 24 horas y no más de 48 horas tras su extracción.
2.2 Una vez preparada, la mezcla reactiva (soluciones de amplificación y sondas) debe utilizarse inmediatamente, o bien puede conservarse durante 2 horas entre +2 °C y +8 °C. 2.3 Repartir 45 μL de esta mezcla reactiva por pocillos, según el plan de placa definido. En los Anexos B y C se proponen planes de placa para los termocicladores Chromo4™/CFX96™ y MiniOpticon™, respectivamente.
El análisis manual permitirá únicamente un análisis cualitativo (presencia o ausencia). Para una interpretación automática es necesario utilizar el software Opticon Monitor™ (versión 3.3 y posteriores) o el software CFX Manager™ Industrial Diagnostic Edition. Será posible imprimir un informe completo (ver instrucciones de software). 1. Controles Antes de la interpretación final de los resultados es necesario verificar los resultados de los controles positivo y negativo.
- Si el CtHEX del control interno es inferior a 28, no es posible interpretar el resultado. Comprobar que se haya colocado el umbral correctamente o que la curva bruta muestre un aspecto característico de amplificación exponencial. Si la curva observada no es correcta, será necesario repetir la prueba de PCR para esa muestra.
13 - RENDIMIENTOS DE LA PRUEBA Y VALIDACIONES La prueba VINEO™ Brettanomytest PCR Kit es específica para la detección de la Brettanomyces bruxellensis. La levadura puede detectarse a partir de: • 500 UFC/mL de vino con el protocolo de extracción de ADN descrito en el kit VINEO™ Extract DNA Kit: 1,8 mL para un mosto en fermentación o un vino pesado durante la vinificación o la crianza.
ANEXO A TABLA DE PREPARACIÓN DE LA MEZCLA REACTIVA DE AMPLIFICACIÓN POR PCR Utilizar esta tabla para determinar las cantidades de sondas fluorescentes y solución de amplificación necesarias para preparar la mezcla reactiva de la PCR. En el cálculo del número de muestras deben incluirse los 2 controles positivos Qs PCR y el control negativo.
ANEXO B PLAN DE PLACA PARA LOS TERMOCICLADORES Chromo4™/CFX96™ Los 3 primeros pocillos de la columna 1 pueden usarse para analizar los 3 puntos de control. Los demás pocillos de la placa se usarán para colocar las muestras que se desee analizar.
AVISO AL COMPRADOR: LICENCIA LIMITADA Este producto está protegido por una o más de las siguientes patentes de EE. UU. y las reivindicaciones de patentes correspondientes fuera de Estados Unidos: 5 079 352, 5 789 224, 5 618 711, 6 127 155, 5 677 152 (sólo reivindicaciones de la 1 a la 23) y 5 773 258 (sólo reivindicaciones de la 1 a la 6) y las reivindicaciones fuera de EE.UU. correspondientes a la patente n° 4 889 818 de EE. UU.
VINEO™ Brettanomytest PCR Kit Rif.
SOMMARIO 1 - INTRODUZIONE 2 - PRINCIPIO DEL VINEO™ Brettanomytest PCR Kit 3 - COMPOSIZIONE DEL KIT 4 - PERIODO DI VALIDITÀ E CONSERVAZIONE 5 - ATTREZZATURA E MATERIALE NECESSARI NON FORNITI 6 - PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI 7 - PRELIEVO E TRASPORTO DEI CAMPIONI 8 - ESTRAZIONE DEL DNA 9 - PCR IN TEMPO REALE 10 - ANALISI DEI DATI 11 - INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 12 - PROTOCOLLO DI CONFERMA A PARTIRE DA COLONIE ISOLATE 13 - PRESTAZIONI DEL TEST E VALIDAZIONI ALLEGATO A - TABELLA DI PREPARAZIONE DELLA MISCEL
1 - INTRODUZIONE Brettanomyces bruxellensis è un lievito responsabile della presenza di 4-etilfenolo e 4 etilguaiacolo nelle bevande quali vini, succhi di frutta e birre che comporta importanti perdite a livello economico. Nei vini, la sua presenza è difficile da rilevare attraverso i metodi di coltura classici, che sono lunghi e non specifici.
• Negativo • Popolazione bassa, rischio controllato • Popolazione critica, da tenere sotto controllo • Popolazione molto elevata, rischio di produzione di Fenoli volatili VINEO™ Brettanomytest PCR Kit può essere utilizzato anche in modalità qualitativa per la conferma di colonie isolate a partire dal mezzo di coltura. 2 - PRINCIPIO DEL VINEO™ Brettanomytest PCR Kit Questo test si basa sull'amplificazione, la rilevazione e la quantificazione di sequenze di DNA mediante la tecnica di PCR in tempo reale.
Questo test consente la rilevazione e la quantificazione di Brettanomyces bruxellensis nei DNA estratti a partire da bevande fermentate ottenute da uva e dai mosti in fermentazione. PRELIEVO DEL CAMPIONE ESTRAZIONE DNA VINEO™ Extract DNA Kit (Rif.: 354-8100) AMPLIFICAZIONE DNA mediante PCR IN TEMPO REALE VINEO™ Brettanomytest PCR Kit (Rif.
Materiali monouso: • Per le piastre, provette per PCR e cappucci: - Piastre bianche da 96 pozzetti “Low-profile”, rif. Bio-Rad: MLL-9651 - Piastre bianche da 48 pozzetti “Low-profile”, rif. Bio-Rad: MLL-4851 - Barrette da 8 provette da 200 μl “Low-profile”, rif. Bio-Rad: TLS-0851 - Barrette da 8 cappucci ottici piatti, per provette o piastre per pozzetti da 0,2 ml, 120 barrette Rif.
Vi raccomandiamo vivamente di leggere l'intero protocollo prima di iniziare il test. Rispettare scrupolosamente il protocollo proposto. 7 - PRELIEVO E TRASPORTO DEI CAMPIONI I campioni di vini vengono prelevati, in condizioni di asepsi, in recipienti sterili di vetro, di polietilene o di materiale simile. I campioni devono essere consegnati al laboratorio il più rapidamente possibile, preferibilmente entro le 24 ore e non oltre le 48 ore successive al prelievo.
2.2 Dopo la preparazione, la miscela di reazione (Soluzioni di amplificazione e di sonde) va utilizzata immediatamente, o può essere conservata per 2 ore ad una temperatura da +2°C a +8°C. 2.3 Ripartire 45 μl di questa miscela di reazione per pozzetto, secondo il piano di piastra definito. Gli Allegati B e C propongono piani di piastra da utilizzare rispettivamente sui termociclatori Chromo4™/CFX96™ e MiniOpticon™.
È necessario utilizzare il software Opticon Monitor™ (versione 3.3 o superiore) oppure il CFX Manager™ software Industrial Diagnostic Edition per un'interpretazione automatizzata e quantitativa. Sarà possibile stampare una relazione completa (Cfr. istruzioni del software). 1. Controlli Prima dell'interpretazione finale dei risultati è necessario verificare i risultati dei controlli negativo e positivo.
Interpretazione dei risultati ottenuti sui campioni: Rilevazione di Brettanomyces bruxellensis (FAM) Rilevazione del controllo interno Ct ≥ 10*** Non significativo Positivo Ct = N/A CtHEX ≥ 28 Negativo Ct = N/A Ct = N/A Inibizione** Interpretazione **: In caso di valore nullo per un campione e il suo controllo interno (Ct = N/A), l'analisi deve essere ripetuta con il campione di DNA diluito ( a 1/5° o a 1/10° per esempio).
ALLEGATO A TABELLA DI PREPARAZIONE DELLA MISCELA DI REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE PCR Utilizzare questa tabella per determinare le quantità necessarie di sonde fluorescenti e soluzione di amplificazione per preparare la miscela di reazione di PCR. Il calcolo del numero di campioni deve includere 2 controlli Qs PCR e il controllo negativo.
ALLEGATO B PIANO DI PIASTRA DA UTILIZZARE SUI TERMOCICLATORI Chromo4™ o CFX96™ I primi 3 pozzetti della colonna 1 possono essere utilizzati per analizzare i 3 punti di controlli. Gli altri pozzetti della piastra saranno utilizzati per deporre i campioni da analizzare.
AVVISO PER L'ACQUIRENTE: LICENZA LIMITATA L'utilizzazione di questo prodotto è tutelata da uno o molti dei seguenti brevetti statunitensi e dalle rivendicazioni di brevetto corrispondenti fuori degli Stati Uniti: 5 079 352, 5 789 224, 5 618 711, 6 127 155, 5 677 152 (unicamente rivendicazioni da 1 a 23) e 5 773 258 (unicamente rivendicazioni da 1 a 6) e dalle rivendicazioni fuori degli Stati Uniti corrispondenti al brevetto USA n. 4 889 818.
Purchaser's information: VINEO is a trademark of Bio-Rad Information à l’acheteur : VINEO is a trademark of Bio-Rad Información al comprador: VINEO es una marca registrada de Bio-Rad Informazione per l'acquirente: VINEO è un marchio registrato di Bio-Rad Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel.: +33 1 47 95 60 00 Fax.: +33 1 47 41 91 33 Rev.
