VINEO™ Extract DNA Kit Ref.
TABLE OF CONTENTS 1 - INTRODUCTION 2 - KIT COMPOSITION 3 - VALIDITY AND PRESERVATION 4 - REQUIRED EQUIPMENT (NOT PROVIDED IN THE KIT) 5 - PRECAUTIONS 6 - SAMPLING AND TRANSPORT OF SAMPLES 7 - DNA EXTRACTION PROTOCOL 9 - CALCULATION OF THE ANALYSED SAMPLING FRACTION 2 © 2010 Bio-Rad
1 - INTRODUCTION Many microorganisms are found in wine. They are major factors in well-known phenomena such as alcoholic and malo-lactic fermentation. Unfortunately, they are also responsible for many changes. A microbiological control is therefore important in order precisely to understand and find out changes in this microbial flora during wine production, and in this way guarantee and control its quality. Wine-making process, maturing, bottling and ageing in bottles must be supervised.
2 - KIT COMPOSITION The VINEO™ Extract DNA Kit product is used to carry out 96 extractions of DNA from samples of wine.
2 - Laboratory Equipment: DNA extraction • Tubes with sterile screws containing 50 mL (1 tube per 45 mL sample analysed) • Tubes with sterile screws containing 2 mL (1 tube per sample whatever the analysed volume) • 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL and 1000 μL micro-pipettes • Cones with sterile filters that are adaptable to 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL and 1000 μL micro-pipettes Other • Non-powdered gloves • Milli Q sterile water (for the 100X W1 dilution to the 1X dilution) • Graduated test tube (for the 100X
Reagent W2 is classified as an irritant in the meaning of the European regulations. Xi (irritant) R36/38 S23-26-37-45-60 (12% acetic acid) Risks: R36/38 - Irritant for eyes and skin Precautions: S23-26-37-45-60 Do not inhale vapours/aerosols. In the event of eye contact, rinse immediately and abundantly with water and consult a specialist. Wear appropriate gloves. In the event of accident or discomfort, consult a doctor immediately (if possible, show him the label).
- DNA EXTRACTION PROTOCOL We strongly recommend that you read the complete protocol before beginning. Follow the suggested protocol scrupulously. The volume of the sample of wine varies according to the intention of the operator and the information expected. • 1.8 mL for fermenting grape must, for heavy wine during the wine-making or maturing process. • 45 mL for slightly heavy wine, close to bottling or already bottled, the analysis of which requires a high level of analytic sensitivity.
2. Washing residue • Add 1.8 mL of diluted W1 • Subject it to a vortex movement using the apparatus provided for this purpose (dissolving residue) • Centrifuge: 5 minutes, at 6000 x g, at 4°C • Dispose of the supernatant fluid • Repeat this step twice At this stage, follow protocol “2°) - Cell lysis” Protocol “45 mL for a slightly heavy wine - “Brett free” test at bottling time” 1.
• Add 100 μL of cool W2 buffer (4°C) • Subject it to a vortex movement for 5 seconds using the apparatus provided for this purpose • Leave the supernatant fluid for 15 min. at 4 ± 2°C (in a refrigerator) • Centrifuge: 15 minutes, at 12 000 x g, at 4°C 3°) - Purifying the DNA 1. Put 500 μL of supernatant fluid from the lysis reaction on a purification column. Warning: do not include resin at the bottom of the tube in the sample. Seal each purification column with recuperation tube stopper.
9. Centrifuge for 3 min., at 1000 x g, at 20°C. Throw away the purification column. Note: In this step, the cap can not be closed. 10. Store the recovery tube containing the 100 μL of purified DNA solution. The DNA solution can be stored for 24 hours at 4°C and several months at -20°C. After storing, centrifuge for 3 min., at 1000 x g, at 20°C. The DNA of the micro-organisms initially present in the sample of wine that are processed in this way may be analysed using a real-time PCR reaction.
Only a 750 μL of the 900 μL of this surnatant fluid from the lysis is purified on the column and is found in concentrate in the 100 μL at the end of stage 3. The fraction preserved during this protocol is therefore 900/750, i.e. 1.2. Z1= 1.2. • Fraction of the initial sample analysed using PCR: Only 5 μL of the 100 μL of eluted DNA are subjected to the PCR. The analysed fraction is therefore 1/20.
APPENDIX 1 Preparation of the quantity required for the W1 washing solution in the 1X dilution to process the samples of grape must/wine with a volume of 1.8 mL. Number of samples Volume of W1 100X (mL) Volume of sterile Mili Q water (mL) Number of samples 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 NA NA NA NA NA NA NA NA NA 0.75 0.83 0.90 0.98 1.05 1.13 1.20 1.28 1.35 1.43 1.50 1.58 1.65 1.73 1.80 1.88 1.
APPENDIX 2 Preparation of the quantity required for the W1 washing solution in the 1X dilution to process the samples of wine with a volume of 45 mL.
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VINEO™ Extract DNA Kit Réf.
SOMMAIRE 1 - INTRODUCTION 2 - COMPOSITION DU KIT 3 - VALIDITÉ ET CONSERVATION 4 - ÉQUIPEMENT ET MATÉRIEL NÉCESSAIRE (NON FOURNI DANS LE KIT) 5 - PRÉCAUTIONS 6 - ÉCHANTILLONAGE ET TRANSPORT DES ÉCHANTILLONS 7 - PROTOCOLE D’EXTRACTION DE L’ADN 8 - CALCUL DE LA FRACTION D’ÉCHANTILLON ANALYSÉE 16 © 2010 Bio-Rad
1 - INTRODUCTION De nombreux microorganismes sont présents dans les vins. Ils sont les acteurs majeurs des phénomènes bien connus : les fermentations alcoolique et malolactique. Ils sont malheureusement aussi responsables de nombreuses altérations. Un contrôle microbiologique est donc important pour comprendre et connaître précisément l’évolution de ces flores microbiennes au cours de l’élaboration du vin, et ainsi garantir et maîtriser sa qualité.
2 - COMPOSITION DU KIT Le produit VINEO™ Extract DNA Kit permet de réaliser 96 extractions d’ADN à partir d’échantillons de vin.
2 - Matériel de laboratoire Extraction de l’ADN • Tubes à vis stériles de contenance de 50 mL (1 tube pour échantillon de 45 mL analysé) • Tubes à vis stériles de contenance de 2 mL (1 tube par échantillon quelque soit le volume analysé) • Micropipettes de 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL et 1000 μL • Cônes à filtre stériles, adaptables sur les micropipettes de 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL et 1000 μL Autres • Gants non poudrés • Eau Milli Q stérile (pour la dilution du W1 100X à la dilution 1X) • Eprouvette gra
Le réactif W2 est classé comme substance irritante au sens de la réglementation européenne. Xi (irritant) R36/38 S23-26-37-45-60 (12% acide acétique) Risques : R36/38 - Irritant pour les yeux et la peau Conseils de prudence : S23-26-37-45-60 Ne pas respirer les vapeurs / aérosols. En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l'eau et consulter un spécialiste. Porter des gants appropriés.
7 - PROTOCOLE D’EXTRACTION DE L’ADN Nous vous recommandons vivement de lire l’ensemble du protocole avant de commencer. Respecter scrupuleusement le protocole proposé. Le volume de l’échantillon de vin est variable selon l’intention du manipulateur et l’information attendue. • 1,8 mL pour un moût en fermentation, un vin chargé en cours de vinification ou d’élevage.
• Centrifuger : 5 minutes, à 6000 x g, à 4°C • Eliminer le surnageant 2. Lavage du culot • Ajouter 1,8 mL de W1 dilué • Vortexer 20 secondes et agiter par retournement du tube (dissolution du culot) • Centrifuger : 5 minutes, à 6000 x g, à 4°C • Eliminer le surnageant • Répéter cette étape 2 fois A cette étape suivre le protocole « 2°) - Lyse des cellules » Protocole « 45 mL pour un vin peu chargé - test « Brett free » à l’embouteillage» 1.
• Incuber les tubes 15 min dans un bloc chauffant à 95°C • Sortir et laisser refroidir 5 min à température ambiante • Ajouter 100 μL de tampon W2 froid (4°C) • Vortexer 5 secondes • Laisser reposer le surnageant pendant 15 min à 4±2°C (réfrigérateur) • Centrifuger : 15 minutes, à 12 000 x g, à 4°C 3°) - Purification de l’ADN 1. Déposer 500 μL de surnageant de la réaction de lyse sur une colonne de purification . Attention, ne pas prélever la résine au fond du tube.
6. Déposer 100 μL de réactif R2 dans la colonne de purification. 7. Jeter le tube de récupération. 8. Couvrir la colonne de purification avec un nouveau tube de récupération propre, retourner l’ensemble. 9. Centrifuger 3 min, à 1000 x g, à 20°C. Jeter la colonne de purification. Remarque : A cette étape, le bouchon ne peut être fermé. 10. Conserver le tube de récupération contenant les 100 μL de solution d’ADN purifié. La solution d’ADN peut être conservée 24 h à 4°C et plusieurs mois à -20°C.
• Fraction de l’échantillon initial présente dans les 100 μL d’ADN extrait à la fin du protocole d’extraction : La totalité des microorganismes présents dans le volume initial d’échantillon de vin (1,8 mL ou 45 mL) se retrouve dans les 900 μL de la fraction « lyse des cellules » à la fin de l’étape 2°. La fraction de cellules initialement présente est inchangée. Jusqu'à cette étape Z0=1.
ANNEXE 1 Préparation de la quantité nécessaire de la solution de lavage W1 à la dilution 1X pour le traitement d’échantillons de moût/vin d’un volume de 1,8 mL. Nombre d'échantillons Volume de W1 100X (mL) Volume d'Eau Mili Q stérile (mL) Nombre d'échantillons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 NA NA NA NA NA NA NA NA NA 0.75 0.83 0.90 0.98 1.05 1.13 1.20 1.28 1.35 1.43 1.50 1.58 1.65 1.73 1.80 1.
ANNEXE 2 Préparation de la quantité nécessaire de la solution de lavage W1 à la dilution 1X pour le traitement d’échantillons de vin d’un volume de 45 mL.
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VINEO™ Extract DNA Kit Ref.
ÍNDICE 1 - INTRODUCCIÓN 2 - COMPOSICIÓN DEL KIT 3 - CADUCIDAD Y CONSERVACIÓN 4 - EQUIPO Y MATERIAL NECESARIOS NO SUMINISTRADOS CON EL KIT 5 - PRECAUCIONES 6 - MUESTREO Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS 7 - PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DEL ADN 8 - CÁLCULO DE LA FRACCIÓN DE MUESTRA ANALIZADA Y DEL FACTOR Z 30 © 2010 Bio-Rad
1 - INTRODUCCIÓN En los vinos hay presentes numerosos microorganismos, que son los principales causantes de fenómenos bien conocidos como las fermentaciones alcohólica y maloláctica. Desafortunadamente, también son los causantes de numerosas alteraciones. Por tanto, es importante el control microbiológico para comprender y conocer de forma precisa la evolución de estas floras microbianas a lo largo de la elaboración del vino, para así garantizar y controlar su calidad.
2 - COMPOSICIÓN DEL KIT El producto VINEO™ Extract DNA Kit permite realizar 96 extracciones de ADN a partir de muestras de vino.
2 - Material de laboratorio: Extracción del ADN • Tubos con tapa de tornillo estériles de 50 mL de capacidad (1 tubo para cada muestra de 45 mL analizada) • Tubos con tapa de tornillo estériles de 2 mL de capacidad (1 tubo por muestra, sea cual sea el volumen analizado) • Micropipetas de 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL y 1000 μL • Conos con filtro estériles, adaptables a las micropipetas de 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL y 1000 μL Otros • Guantes sin polvo • Agua Milli-Q estéril (para la dilución del W1 100X a 1
El reactivo W2 está clasificado como sustancia irritante según la normativa europea. Xi (irritant) R36/38 S23-26-37-45-60 (12% ácido acético) Riesgos: R36/38: Irrita los ojos y la piel Consejos de precaución: S23-26-37-45-60 No respirar los vapores/aerosoles. En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. Úsense guantes adecuados. En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).
7 - PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DEL ADN Recomendamos encarecidamente leer el protocolo completo antes de empezar. Cumpla escrupulosamente el protocolo propuesto. El volumen de la muestra de vino varía según la intención del manipulador y la información que se espere. • 1,8 mL para un mosto en fermentación o un vino pesado durante la vinificación o la crianza. • 45 mL para un vino poco pesado, próximo al embotellado o ya embotellado cuyo análisis precise de un nivel elevado de sensibilidad analítica.
1°) - Concentración y lavado de las células del vino Protocolo «1,8 mL para un mosto en fermentación o un mosto-vino pesado durante el proceso de vinificación o la crianza» 1. Concentración de las células • Sacar 1,8 mL del mosto/vino que se desee analizar y ponerlos en un tubo de 2 mL con tapa de tornillo estéril. • Centrifugar durante 5 minutos a 6000 x g y 4°C. • Eliminar el sobrenadante. 2. Lavado del residuo • Añadir 1,8 mL de W1 diluida.
• Eliminar el sobrenadante. A partir de aquí, seguir el protocolo «2) Lisis de las células». 2°) - Lisis de las células A partir de esta etapa, trabajar con guantes sin polvo. • Añadir 800 μL de tampón R1. • Agitar con vórtex durante 20 segundos y dándole la vuelta al tubo. • Incubar los tubos 15 minutos en un bloque térmico a 95°C. • Sacarlos del bloque térmico y dejar enfriar a temperatura ambiente durante 5 minutos. • Añadir 100 μL de solución W2 fría (4°C). • Agitar con vórtex durante 5 segundos.
5. Centrifugar durante 10 minutos a 6000 x g y 20°C. Observaciones: • En caso de obturación de la columna de purificación, aumentar el tiempo de centrifugación sin aumentar la velocidad. • Comprobar que todo el sobrenadante haya atravesado completamente la columna. Si no fuera así, volver a centrifugar.
El valor de Z es específico para cada protocolo de extracción. Aquí, la fracción de la muestra analizada mediante PCR corresponde a 1/24 del volumen total del vino tratado (1,8 o 45 mL) en el caso de que se analicen mediante PCR 5 μL de ADN extraído puro. El factor Z corresponde al denominador de la fracción analizada. El valor del factor Z para el protocolo actual es Z=24.
ANEXO 1 Preparación de la cantidad necesaria de la solución de lavado W1 en dilución 1x para el tratamiento de muestras de mosto/vino de 1,8 mL. Número de muestras Volumen de W1 100X (mL) Volumen de agua Milli Q estéril (mL) Número de muestras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 NA NA NA NA NA NA NA NA NA 0.75 0.83 0.90 0.98 1.05 1.13 1.20 1.28 1.35 1.43 1.50 1.58 1.65 1.73 1.80 1.88 1.95 2.03 2.
ANEXO 2 Preparación de la cantidad necesaria de la solución de lavado W1 en dilución 1x para el tratamiento de muestras de vino de 45 mL.
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VINEO™ Extract DNA Kit Rif.
SOMMARIO 1 - INTRODUZIONE 2 - COMPOSIZIONE DEL KIT 3 - PERIODO DI VALIDITÀ E CONSERVAZIONE 4 - ATTREZZATURA E MATERIALE NECESSARIO (NON FORNITO CON IL KIT) 5 - PRECAUZIONI 6 - PRELIEVO E TRASPORTO DEI CAMPIONI 7 - PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE DEL DNA 8 - CALCOLO DELLA FRAZIONE DI CAMPIONE ANALIZZATO 44 © 2010 Bio-Rad
1 - INTRODUZIONE Nel vino sono presenti numerosi microrganismi. Sono i protagonisti principali di fenomeni ben conosciuti: la fermentazione alcolica e malolattica. Malauguratamente, sono anche responsabili di numerose alterazioni. È quindi importante un controllo microbiologico per comprendere e conoscere con precisione l'evoluzione di questa flora microbica nel corso della vinificazione, e garantire e controllare in tal modo la qualità del vino.
2 - COMPOSIZIONE DEL KIT Il prodotto VINEO™ Extract DNA Kit permette di effettuare 96 estrazioni di DNA a partire da campioni di vino.
2 - Materiale di laboratorio Estrazione del DNA • Provette con tappo a vite sterili di capacità 50 mL (1 provetta per campione da 45 mL analizzato) • Provette con tappo a vite sterili di capacità 2 mL (1 provetta per campione indipendentemente dalla quantità analizzata) • Micropipette da 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL e 1000 μL • Coni con filtro sterili, adattabili alle micropipette da 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL e 1000 μL Altri • Guanti non talcati • Acqua Milli Q sterile (per la diluizione del W1 100X alla
Il reagente W2 è classificato come sostanza irritante ai sensi della normativa europea. Xi (irritant) R36/38 S23-26-37-45-60 (12% acido acetico) Rischi: R36/38 – Irritante per gli occhi e per la pelle Consigli di prudenza: S23-26-37-45-60 Non respirare i vapori / aerosol. In caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare uno specialista. Indossare guanti adatti.
7 - PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE DEL DNA Vi consigliamo vivamente di leggere tutto il protocollo prima di iniziare. Rispettare scrupolosamente il protocollo proposto. Il volume del campione di vino varia a seconda dell'intenzione di colui che esegue l'analisi e dell'informazione attesa.
• Centrifugare: 5 minuti, a 6000 x g, a 4°C • Eliminare il surnatante 2. Lavaggio del sedimento • Aggiungere 1,8 mL di W1 diluito • Agitare con il Vortex per 20 secondi e agitare capovolgendo la provetta (dissoluzione del sedimento) • Centrifugare: 5 minuti, a 6000 x g, a 4°C • Eliminare il surnatante • Ripetere questa fase 2 volte In questa fase seguire il protocollo “2°) – Lisi delle cellule” Protocollo “45 mL per un vino poco carico – test “Brett free” all'imbottigliamento” 1.
• Incubare le provette 15 min in un blocco riscaldate a 95°C • Tirarle fuori dal blocco e farle raffreddare per 5 min a temperatura ambiente • Aggiungere 100 μL di tampone W2 freddo (4°C) • Agitare con il Vortex per 5 secondi • Far riposare il surnatante per 15 min a 4 ± 2°C (frigorifero) • Centrifugare: 15 minuti a 12000 x g, a 4°C 3°) - Purificazione del DNA 1. Deporre 500 μL di surnatante della reazione di lisi su una colonna di purificazione. Attenzione, non prelevare la resina al fondo della provetta.
6. Porre 100 μL di reagente R2 nella colonna di purificazione. 7. Gettare la provetta di recupero. 8. Coprire la colonna di purificazione con una nuova provetta di recupero pulita, e capovolgere il tutto giù. 9. Centrifugare 3 min, a 1000 x g, a 20°C. Gettare la colonna di purificazione. Nota: A questa fase il tappo non può essere chiuso. 10. Conservare la provetta di recupero che contiene i 100 μL di soluzione di DNA purificato.
Il valore del fattore Z per il presente protocollo è Z = 24. Viene calcolato nel modo seguente: • Frazione del campione iniziale presente nei 100 μL di DNA estratto al termine del protocollo di estrazione: La totalità dei microrganismi presenti nel volume iniziale del campione di vino (1,8 mL o 45 mL) si trova nei 900 μL della frazione “lisi delle cellule” alla fine della fase 2°. La frazione di cellule inizialmente presente è invariata. Fino a questa fase Z0=1.
ALLEGATO1 Preparazione della quantità necessaria della soluzione di lavaggio W1 alla diluizione 1X per il trattamento di campioni di mosto/vino di un volume di 1,8 mL. Numero di campioni Volume di W1 100X (mL) Volume di Acqua Mili Q sterile (mL) Numero di campioni 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 NA NA NA NA NA NA NA NA NA 0.75 0.83 0.90 0.98 1.05 1.13 1.20 1.28 1.35 1.43 1.50 1.58 1.65 1.73 1.
ALLEGATO 2 Preparazione della quantità necessaria della soluzione di lavaggio W1 alla diluizione 1X per il trattamento di campioni di vino di un volume di 45 mL.
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